Туалет естественных складок

Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Окрашивание гелей серебром.

Серебряное окрашивание белковых SDS-PAA гелей (аммонийный метод).

Наиболее чувствительный метод окрашивания белковых гелей. Но и наиболее трудоёмкий.


  1. Фиксация.

  2. фиксировать в 20% ТХУ, >1h (больше для высокопроцентных гелей; ещё лучше ON);
  3. 2x20' "Stop";
  4. 2x20' H2O.

    Сенситизация.

  5. 30' в 10% глутаральдегиде;
  6. 3x20' H2O.

    Окрашивание.

  7. 30' SD;
  8. 3x5' H2O.

    Проявление.

  9. 5-10' в проявителе;
  10. остановить 3-5' в "Stop";
  11. перед хранением или сушкой сполоснуть в H2O.

Проявитель

(хранить при NT):

Конц. Сток 100ml

Citric acid

0.005% (w/v) 1% (w/v) 0.5ml

Formaldehyde

0.019% (w/v) 36% (w/v) 52µl

H2O

    99.45ml естественных

Stop

(хранить при NT):

Конц. Сток 500ml

EtOH

40% 96% 208ml

Уксусн. к-та

10% 100% 50ml

H2O

  mQ 242ml



  • Комментарии.

    Общие.

  • Чувствительность 0.1-1.0ng белка на бэнд.
  • Метод весьма чувствителен, поэтому необходимо:
  • работать только в перчатках;
    качество воды очень критично, на всех этапах использовать только mQ.

  • нельзя использовать b-MeEtOH в качестве агента, восстанавливающего дисульфидные связи: он вызывает появление двух артефактных полос в районе 50 и 67kDa.
  • серебряное окрашивание мешает экспозиции3H - изотопов.
  • сообщалось о возможности повысить чувствительность метода в 2-9/40-50 раз с помощью двойного окрашивания: предварительное окрашивание Coomassie Blue (нормальная/колоидная форма), а затем - серебряное окрашивание.
  • Вещества, влияющие на окрашивание:
  • SDS
    Глицин
    Tris
    Мочевина
    Глицерин
    Уксусная кислота
    Белки - вызывают сильное фоновое окрашивание

    По пунктам.

    п. 6.

  • К NH4(35%) добавить 0.1M NaOH, затем, перемешивая, понемногу добавлять AgNO3. Когда выпадет коричневый осадок, растворить добавлением минимального количества NH4. Довести объем до 100 ml H2O. Раствор нестабилен, должен быть использован в течение 5'. окрашивание проводится только в перчатках.
  • п. 8.

  • После 10' существенно возрастает фон.
  • Проявление продолжается ещё 2-4' после удаления геля из проявителя.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail:


Rambler's Top100

Hosted by uCoz

Источник: http://dmaks2007.narod.ru/protocol/17_04.html

Закрыть ... [X]

Праздничные прически 2017: 15 пошаговых причесок с Папоротник на даче посадка и уход



Туалет естественных складок В подполье можно встретить только крыс читать
Туалет естественных складок Прически на средние волосы своими руками
Туалет естественных складок Ремонт ванной комнаты своими руками: видео и фото, инструкция
Туалет естественных складок Итальянский рецепт жареного угря
Туалет естественных складок Заговоры на любовь. Любовные привороты на Луну
Туалет естественных складок Обворожительные прически для подружки невесты
Сухая кожа лица / Сухие пятна на коже 20 средств против целлюлита: тест-клуб Allure Жжение и зуд в заднем проходе после поноса: лечение, причины Модные прически на тонкие и редкие волосы: правила ухода, варианты Женская одежда от белорусских производителей / каталог сайтов Реляционная модель данных. Понятие сущности и отношения Сухая кожа на ногах, причины, увлажнение, 5 рецептов масок Работа администратором салона в Москве - 78 вакансий на